肿瘤微环境在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，该环境具有酸性、低JD足球反波胆APP下载和大量免疫抑制性细胞因子等特征。酸性是肿瘤微环境的一个非常显著的生物学特性，其JD足球反波胆APP下载介于5.8～7.4。目前肿瘤微环境的酸性特性已成为抗肿瘤领域研究热点之一，已经证明改变细胞外酸性微环境能有效影响肿瘤细胞的增殖，例如升高胞外微环境JD足球反波胆APP下载能加速肿瘤细胞凋亡和坏死。结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，也是导致死亡率较高的一种癌症。目前，受益于检测技术的提高，CRC患者获得治疗的机会增加，CRC患者的复发率以及生存率提高，给肿瘤患者的进一步治疗既提供了机会、又提出了挑战。细胞生物力学特性可以反映细胞结构和功能之间的关系，在机体免疫中具有重要意义。因此，本研究以人体接近的JD足球反波胆APP下载7.3作为对照通过观察不同JD足球反波胆APP下载环境对结肠癌CT26细胞生物力学特性的影响，为肿瘤微环境改变对肿瘤影响机制提供依据。


1材料与方法


1.1材料


1.1.1主要试剂小鼠结肠癌CT26细胞(课题组保存)、10%胎牛血清(美国Gibco公司)、RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)、盐酸(无锡亚盛化工有限公司)、氢JD足球反波胆APP下载化钠(美国Sigma公司)、Cell Counting Kit 8(CCK8)、罗丹明标记的鬼笔环肽、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-JD足球反波胆APP下载enylindole,DAPI)、Triton-X100(北京索莱宝公司)。


1.1.2主要仪器


台式低速离心机(上海安亭科学仪器厂)、CO2培养箱(美国Thermo Fisher公司)、细胞电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、F-4600荧光分光光度计(日本Hitachi公司)、激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司)、JD足球反波胆APP下载JD足球反波胆APP下载（丹麦JD足球反波胆APP下载公司）。


1.2方法


1.2.1不同JD足球反波胆APP下载培养基配置


JD足球反波胆APP下载6.5与JD足球反波胆APP下载7.8 RPMI-1640培养基分别由盐酸与氢JD足球反波胆APP下载化钠调节JD足球反波胆APP下载7.3 RPMI-1640培养基配制而成。


1.2.2CT26的培养


液氮罐中取出冻存的肠癌CT26细胞，水浴锅速溶，1 000 r/min离心5 min，去上清，用10%含胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，37℃、5%CO2条件培养。


1.2.3CT26活力检测

当细胞铺板面积达约90%时，将CT26分为JD足球反波胆APP下载6.5、JD足球反波胆APP下载7.3和JD足球反波胆APP下载7.8组，分别加入JD足球反波胆APP下载6.5、JD足球反波胆APP下载7.3与JD足球反波胆APP下载7.8条件培养基，96孔板中培养(100μL/孔)24 h，然后向培养板加入CCK-8溶液(10μL/孔)，37℃、5%CO2条件培养2 h，酶标仪450 nm波长下测量每孔吸光度，计算活细胞占总细胞的百分比为细胞活力。


1.2.4CT26电泳迁移率(cell electroJD足球反波胆APP下载oresisi mobility,EPM)


分别收集JD足球反波胆APP下载6.5、JD足球反波胆APP下载7.3与JD足球反波胆APP下载7.8组的CT26细胞，PBS漂洗、10%蔗糖溶液重悬，将细胞悬液加至细胞电泳小室静止层中观察，计算EPM，以此反映细胞表面负电荷量。


1.2.5CT26细胞膜流实验


分别收集JD足球反波胆APP下载6.5、JD足球反波胆APP下载7.3与JD足球反波胆APP下载7.8条件培养基处理后的CT26细胞，PBS漂洗，无菌避光条件加入DJD足球反波胆APP下载 800μL重悬细胞，封口、培养30 min，离心弃上清，PBS洗涤、PBS重悬细胞后用荧光分光光度计测量细胞偏振度参数，按曾柱等方法计算荧光偏振度(P)。P与细胞膜流动性呈负相关。


1.2.6丝状肌动蛋白(filament actin,F-actin)表达


由F-actin构成的微丝主要通过解聚与聚合来调控细胞形态和迁移能力。分别收集JD足球反波胆APP下载6.5、JD足球反波胆APP下载7.3与JD足球反波胆APP下载7.8组的CT26细胞，4%多聚甲醛固定20 min，吸弃多聚甲醛，PBS漂洗，Triton-100处理，PBS漂洗，罗丹明标记的鬼笔环肽处理，避光12 h，PBS漂洗，加入DAPI、PBS漂洗，加入防荧光淬灭剂油、封片，4℃避光保存备用。共聚焦激光扫描显微镜观察、拍照，Imagej软件测量细胞荧光值(F-actin表达量)。实验重复3次，每次实验每个处理组以随机方式选择3个细胞测量荧光值。


1.3统计学分析


2结果


2.1 CT26的细胞活力


JD足球反波胆APP下载6.5和JD足球反波胆APP下载7.8组的CT26的细胞活力与JD足球反波胆APP下载7.3组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1不同JD足球反波胆APP下载对CT26活力的影响


2.2 CT26的EPM


与JD足球反波胆APP下载7.3组相比，JD足球反波胆APP下载6.5组EPM变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)；JD足球反波胆APP下载7.8组EPM明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)，表明碱性条件JD足球反波胆APP下载7.8处理能降低CT26表面的负电荷量。见图2。

注：(1)与JD足球反波胆APP下载7.3组比较，P<0.05。图2不同JD足球反波胆APP下载对CT26细胞EPM的影响


2.3 CT26细胞膜流动性


与JD足球反波胆APP下载7.3组CT26细胞的P值相比，JD足球反波胆APP下载6.5组变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)；JD足球反波胆APP下载7.8组P值增加，差异有统计学意义(P<0.05)，说明碱性条件JD足球反波胆APP下载7.8处理能降低CT26细胞膜流动性。见图3。

注：(1)与JD足球反波胆APP下载7.3组比较，P<0.05。图3不同JD足球反波胆APP下载对CT26细胞P值的影响


2.4 F-actin的表达


与JD足球反波胆APP下载7.3组CT26的F-actin表达相比，JD足球反波胆APP下载6.5组F-actin的变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)；而JD足球反波胆APP下载7.8组CT26中F-actin表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：A图为荧光图，B图统计图；(1)与JD足球反波胆APP下载7.3组比较，P<0.05。图4不同JD足球反波胆APP下载对F-actin表达的影响


3讨论


CRC是常见的消化道恶性肿瘤，死亡率较高。在我国，随着人民饮食结构的改变，特别是高脂肪饮食增加而纤维食物不足的状况日益严重，CRC发病率持续上升。结肠癌由于存在高转移率特性，使得患者确诊后5年生存率很低。因此，找到一种有效的结肠癌治疗方法对人类来说具有重大意义。酸性是肿瘤微环境的一个非常显著的生物学特性，其在肿瘤进展过程中发挥了关键作用。目前很多学者已经把改变酸性微环境JD足球反波胆APP下载作为肿瘤治疗方法来研究。细胞生物力学特性在机体免疫中具有重要意义。因此，本项目以细胞生物力学特性为出发点来研究不同JD足球反波胆APP下载对结肠癌CT26细胞功能的影响，为了进一步了解JD足球反波胆APP下载在结肠癌治疗过程中的作用提供更多理论依据。


细胞生物力学特性能反映细胞结构和功能之间的关系，包括细胞膜电特性、渗透脆性、膜流动性和F-actin等。本文研究不同JD足球反波胆APP下载对CT26细胞膜电特性、膜流动性和细胞骨架结构的影响。细胞膜电特性在细胞与细胞间的相互作用中发挥着重要的作用，可用EPM来反映。本实验结果显示，碱性条件JD足球反波胆APP下载7.8处理能够抑制CT26的EPM，表明JD足球反波胆APP下载7.8能使CT26的表面负电荷减少。人体抗原呈递细胞表面均带负电荷。肿瘤免疫中，CT26表面负电荷减少可能导致其与抗原呈递细胞间的推斥力减少，即碱性条件JD足球反波胆APP下载7.8处理可能增加CT26与抗原呈递细胞的结合作用，这可能有利于抗肿瘤免疫调控。膜流动性是一个重要的细胞生物力学指标，反映细胞膜脂双层分子运动状况，与细胞迁移能力相关。碱性条件JD足球反波胆APP下载7.8处理能降低CT26的膜流动性，提示结肠癌酸性微环境中增加JD足球反波胆APP下载有可能抑制肿瘤细胞膜分子运动。真核细胞骨架主要包括微丝、微管与中间纤维。构成微丝的F-actin在多种结合蛋白的调控下，产生解聚和聚合来调控细胞的形态、伪足形成与迁移。本结果发现，碱性条件JD足球反波胆APP下载7.8处理使CT26的F-actin表达减少，提示碱性条件JD足球反波胆APP下载7.8可能通过抑制F-actin表达进而调控CT26的迁移。


综上所述，本研究发现碱性条件JD足球反波胆APP下载7.8能抑制CT26的膜负电荷量、膜流动性和F-actin的表达量，而酸性条件JD足球反波胆APP下载6.5对这几种细胞生物力学特性无影响。